Welcome to the Congress Portal, چهارمين كنگره آزمايشگاه و بالين

Font Size: 
بررسی عملکرد لنفوسيتهای CD4+/CD8+ T تخليص شده با نانوپارتيکل های مغناطيسی در کشت سلولی
Mahmoud Nateghi Rostami, Hossein keshavarz, Ali Khamesipour, Akram Miramin Mohammadi, Ebrahim Eskandari, Abdolfattah Sarrafnejad

Last modified: 2011-11-30

Abstract


زمینه و هدف: بررسی عملکرد لنفوسیتهای T در بیماریهای مختلف، از جمله لیشمانیوز جلدی (سالک)، اغلب مبتنی بر تعیین تکثیر سلولی و ترشح سایتوکاینها در شرایط in vitro است. اما اغلب مطالعات به کشت سلولهای تک هسته خون محیطی (peripheral blood mononuclear cells=PBMC) که مجموعه ای ناهمگون از لنفوسیتهای T CD4+ و CD8+، مونوسیتها، سلولهای کشنده طبیعی (NK cells)، و لنفوسیتهای B هستند، عملکرد لنفوسیتی را گزارش می کنند. در این مطالعه، لنفوسیتهای T حاصل از بیماران تفکیک شده و ترشح سایتوکاینها پس از کشت سلولی مورد بررسی قرار گرفته است.

روش: نمونه خون هپارینه وریدی از بیماران بهبود یافته از سالک و گروه شاهد سالم جمع آوری شد. سلولهای PBMC با روش سانتریفوژ بر روی محلول فایکول جداسازی شدند. لنفوسیتهای T CD4+ و CD8+ و مونوسیتهای CD16-CD14+ با استفاده از نانوپارتیکل های مغناطیسی و مونوکلونال آنتی بادی ضد مارکرهای CD4+ وCD8+ (روش magnetic activated cell sorting=MACS) از PBMC جدا شدند. خلوص لنفوسیتها پس از رنگ آمیزی مارکر با روش فلوسایتومتری بررسی شد. لنفوسیتهای تخلیص شده بطور مجزا در کنار مونوسیتهای اتولوگ به نسبت 1 به 10 کشت داده شدند. سلولها با آنتی ژن محلول تهیه شده از لیشمانیا ماژور و یا PHA بمدت 72 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و 5% CO2 تحریک شدند. پس از انکوباسیون، میزان سایتوکاین های ترشحی در سوپرناتانت کشت سلولی با روش ساندویچ الایزا اندازه گیری شد.

نتایج: میزان خلوص لنفوسیتها بیش از 96% بطور متوسط برای هر یک از لنفوسیتهای تفکیک شده بدست آمد. در نمونه های حاصل از افراد بهبود یافته از سالک، کشت خالص لنفوسیتهای T CD4+ و CD8+ در حضور مونوسیتهای خون محیطی با موفقیت انجام شد. نتایج حاصل از الایزا افزایش میزان سایتوکاین IFN-γ را در لنفوسیتهای T CD4+ و CD8+ در این افراد در مقایسه با سلولهای شاهد نشان داد (P<0.05). البته میزان این افزایش در لنفوسیتهای T CD4+ بطور معنی داری بیش از  CD8+ بدست آمد. سایتوکاینهای IL-10 و IL-13 نیز در سوپرناتانت کشت سلولی لنفوسیتها اندازه گیری شدند، اما تغییر معنی داری در سلولهای افراد بهبود یافته از سالک در مقایسه با سلولهای گروه شاهد سالم مشاهده نشد.

نتیجه گیری: در این روش لنفوسیتهای T CD4+ و CD8+ با ذرات مغناطیسی تخلیص شدند. کشت خالص لنفوسیتی با مونوسیتهای اتولوگوس در حضور آنتی ژن اختصاصی انجام گرفت. در کشت خالص برخلاف کشت PBMC که مجموعه ای از سلولهای ایمنی خون محیطی را شامل می شود، امکان بررسی عملکرد هر گروه از لنفوسیتهای T CD4+ و CD8+ بطور مجزا وجود دارد.

کلمات کلیدی: لنفوسیتهای T، لیشمانیوز جلدی، کشت سلولی

Functional analysis of magnetically purified CD4+/CD8+ T lymphocytes in cell culture

 

Mahmod Nateghi Rostamia, Hossein Keshavarzb, Ali Khamesipourc, Akram Miramin Mohammadic, Seyed Ebrahim Eskandaric, Abdolfattah Sarraf Nejadd

 

a Faculty of Medicine, Qom University of Medical Sciences, Saheli St. 14739-79966, Qom, Iran; Email:rostami52@yahoo.com

 

b Medical Parasitology and Mycology Department, School of Public Health, Tehran University of Medical Sciences; Tehran, Iran

 

c Center for Research and Training in Skin Diseases and Leprosy, Tehran University of Medical Sciences; Tehran, Iran

 

d Division of Immunology, Department of Pathobiology, School of Public Health, Tehran University of Medical Sciences; Tehran, Iran

 

Background: Determination of the function of T cells in different infectious diseases, including cutaneous leishmaniasis (CL), is based on proliferation and cytokine production assays in vitro. In leishmaniasis, most of the data generated so far is drawn from culture of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) which are heterogeneous populations of CD4+ and CD8+ T cells, B cells and NK cells. In this study CD4+ and CD8+ T cells were isolated and cytokine productions were analysed after culture.

Methods: Blood samples were collected from volunteers with history of CL and healthy controls from endemic areas. PBMCs were isolated by using Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation. CD4+and CD8+lymphocytes and CD14+ monocytes isolation was performed using magnetic nanoparticles and cocktail mAbs from PBMC. The purity of yielded lymphocytes and monocytes was assessed by flow cytometry using conjugated mAbs. Purified CD4+ or CD8+ lymphocytes were co-cultured with 1:10 autologous monocytes in the presence of PHA or soluble Leishmania antigen (SLA) for 72 hrs at 37° C with 5% CO2. Cytokine productions were measured on supernatant by using ELISA method.

Results: The purity of yielded lymphocytes and monocytes were more than 96% by flow cytometry. Purified CD4+/CD8+ T lymphocytes culture with autologous monocytes were done successfully. Stimulation of either CD4+ T cells or CD8+ T cells of CL volunteers with SLA induced a significantly (P<0.05) higher IFN-γ production compared with the cells of controls. The levels of IL-10 and IL-13 were measured but not significantly different in either CD4+ or CD8+ T cells between CL volunteers and controls.

Conclusion: In this experiment CD4+ and CD8+ T cells were isolated with magnetic beads. Purified T lymphocyte culture was performed in the presence of SLA. Unlike PBMC culture, in T lymphocyte culture it is possible to define the different T cell functions in culture.

Key words: CD4+/CD8+ T lymphocytes, MACS, Cutaneous leishmaniasis